Single-cell RNA-seq analysis of mouse testes with gonadal defects

PRIMARY OUTCOME

Identification of gene regulatory programs and cell populations in normal and defective spermatogenesis

EXPECTED OUTCOMES

1. **细胞捕获效率与数据质量** - 每个样本成功捕获有效细胞数：8,000-12,000 cells/sample (中位数>10,000) - 平均测序深度：50,000-70,000 reads/cell (中位数>55,000 reads/cell) - 基因表达中位数：1,200-1,800 genes/cell 2. **细胞群体组成变化** - 野生型小鼠睾丸组织预期鉴定出12-15种主要细胞类型 - 与野生型相比，突变体小鼠预期检测到精母细胞比例显著降低：Mlh3-/-组预计降低35-50%，Hormad1-/-组预计降低40-55% - 突变体小鼠睾丸组织预期检测到1-3种异常细胞群体(如凋亡前体细胞、增殖异常细胞) 3. **差异表达基因数量** - 每种突变体与野生型比较预期识别出300-800个差异表达基因(padj < 0.05, |log2FC| > 0.5) - 上调基因预计占差异表达基因的45-55%，下调基因占45-55% 4. **基因功能富集** - 预期在所有突变体中共同富集的通路：DNA重组修复通路、减数分裂进程、细胞周期调控 - Mlh3-/-特异性富集：错配修复通路(MMR pathway) - Hormad1-/-特异性富集：染色体联会与交叉重组 - Cul4a-/-特异性富集：泛素-蛋白酶体降解通路 - Cnp-/-特异性富集：髓鞘形成与神经细胞发育相关通路 5. **细胞通讯改变** - 突变体睾丸组织预期识别出50-150对差异表达的配体-受体互作对 - 支持细胞-生殖细胞间通讯预计在突变体中显著增强或减弱(FDR < 0.05) 6. **转录因子网络** - 预期识别出8-15个核心转录因子在突变体中表达显著改变 - 已知关键转录因子(如Taf7l, Rfx2, Creb)预期在突变体中表达量下降40-70% 7. **精子发生障碍程度量化** - 突变体小鼠预期曲细精管直径减少15-25% - 突变体小鼠预期精子数量减少60-90% (通过手术取样后精子计数) - 突变体小鼠预期附睾精子活力降低50-80% ---

SUCCESS CRITERIA

1. **数据质量阈值** - 每个样本的有效细胞捕获数≥8,000 cells (中位数) - 测序数据Q30碱基比例>85% - 基因表达中位数>1,000 genes/cell - ✓ 通过标准：达到上述全部指标 2. **统计显著性** - 差异表达基因分析：padj < 0.05 ( Benjamini-Hochberg校正) - 每种突变体vs野生型比较的统计功效>0.80 (power analysis) - ✓ 通过标准：主要差异基因p值满足多重校正FDR<0.05 3. **生物学重复性** - 同一基因型内样本间Pearson相关系数r>0.85 - 主成分分析(PCA)显示同基因型样本聚类在一起 - ✓ 通过标准：基因型内重复性满足r>0.80 4. **功能验证一致性** - qRT-PCR验证的关键差异基因表达趋势与scRNA-seq结果一致率>80% - RNAscope原位杂交的空间表达模式与scRNA-seq细胞定位一致 - ✓ 通过标准：功能验证一致率>75% 5. **细胞群体鉴定** - 使用已知标记基因成功注释>90%的细胞 - 每个样本成功识别至少10种主要细胞类型 - ✓ 通过标准：细胞注释完整率>85% 6. **生物信息学分析完整性** - 完成差异表达分析、GO富集分析、KEGG通路分析、GSEA分析 - 细胞通讯分析与转录因子网络分析均完成 - ✓ 通过标准：全部分析流程完成且结果可解释 7. **研究影响评估** - 识别出至少5个可作为男性不育症诊断生物标志物的候选基因 - 鉴定出至少3个可作为药物靶点的关键通路 - 与已发表单细胞睾丸数据(Maybe et al., 2020; Green et al., 2022)进行比较，重叠差异基因>30% - ✓ 通过标准：至少满足上述一项转化价值指标

PROTOCOL

### 单细胞RNA-seq分析小鼠睾丸基因缺陷与精子发生缺陷的基因调控程序和细胞群体研究 --- ### 阶段 I：动物模型建立与睾丸组织采集（第1-4周） **时间点：** - 交配后8周龄取材 - 每个基因型组：n=6只雄性小鼠（3只用于scRNA-seq，3只用于验证实验） **方法：** 1. 小鼠品系确认与基因分型 - 提取鼠尾基因组DNA，使用PCR进行基因型鉴定 - 引物序列： - Mlh3: Forward 5'-GCTGGAGCCTGTCTTCCTTC-3', Reverse 5'-CAGGATGCCCTTCAGTCTTG-3' - Hormad1: Forward 5'-GGAGGTGGTGGTCATCGTCT-3', Reverse 5'-GCAAAGTGGAGGAGTAGGCG-3' - Cul4a: Forward 5'-CTGCTGCTGTACCTGGACA-3', Reverse 5'-GGCTTCCTCTGCTTCGTCAT-3' - Cnp: Forward 5'-GTGGCTGAGATGTGGGTGAA-3', Reverse 5'-CTCCAGCATCACGGTCTTCA-3' - 反应体系：Taq DNA聚合酶25μL体系，退火温度58°C，35个循环 2. 睾丸摘取与处理 - CO₂吸入麻醉后颈椎脱臼处死 - 迅速摘取双侧睾丸，4°C预冷的PBS清洗3次去除血细胞 - 剥离睾丸白膜，仔细分离曲细精管 - 在37°C恒温振荡器中用Collagenase IV (1 mg/mL, Worthington #LS004188)处理15分钟分散细胞 - 通过40μm细胞筛网(Falcon #352340)过滤获得单细胞悬液 **试剂与设备：** - Collagenase IV (Worthington, #LS004188) - DNase I (Sigma-Aldrich, #D5025-150KU) 100 μg/mL - ACK裂解缓冲液(Thermo Fisher, #A1049201) - 流式细胞仪(FACSAria III, BD Biosciences) **对照设置：** - 野生型C57BL/6J小鼠作为阳性对照 - 同窝阴性 littermate WT小鼠排除遗传背景干扰 - 已知精子发生障碍模型(Clgn knockout)作为疾病内参 --- ### 阶段 II：单细胞悬液制备与质量控制（第3-5周） **方法：** 1. 细胞活力检测 - 台盼蓝拒染法计数活细胞，存活率需>85% - 目标活细胞数：每个样本≥500,000个活细胞 2. 细胞计数与浓度调整 - 使用血细胞计数器(Neubauer Improved)或自动细胞计数仪(Countess III) - 调整至1,000 cells/μL浓度，冰上保存于DMEM/F12培养基(含10% FBS) 3. 质量控制标准 - 文库构建前进行small RNA电泳分析(Bioanalyzer 2100, Agilent) - RIN值需>8.0 - OD260/280比值1.8-2.0 **试剂与设备：** - DMEM/F12培养基(Thermo Fisher, #11330032) - FBS (Gibco, #16000044) - 台盼蓝溶液(0.4%, Sigma-Aldrich, #T8154) - Countess III自动细胞计数仪(Thermo Fisher) --- ### 阶段 III：单细胞RNA-seq文库构建与测序（第5-10周） **方法：** 1. 单细胞捕获 - 采用10x Genomics Chromium系统进行液滴包封 - 目标捕获细胞数：10,000 cells/sample - 使用10x Chromium Next GEM Chip K - 试剂：Chromium Next GEM Single Cell 3' Kit v3.1 (10x Genomics, #1000128) 2. 文库构建流程 - 细胞悬液与油珠乳液(Oil)结合形成GEMs - 逆转录：53°C 45分钟，85°C 5分钟 - PCR扩增：98°C 3分钟；12个循环(98°C 15秒，67°C 20秒，72°C 1分钟)；72°C 1分钟 - 片段化：54°C 15分钟，65°C 20分钟 - 文库纯化：Agencourt AMPure XP beads (Beckman Coulter) 3. 测序参数 - Illumina NovaSeq 6000平台 - 测序深度：50,000 reads/cell - 双端150bp读长(Paired-end 150bp) - 目标数据量：每个样本≥500M reads **试剂与设备：** - Chromium Next GEM Single Cell 3' Kit v3.1 (10x Genomics, #1000128) - Chromium Controller (10x Genomics) - Illumina NovaSeq 6000 (Illumina) - Qubit fluorometer (Thermo Fisher) --- ### 阶段 IV：生物信息学分析（第10-18周） **分析流程：** 1. 原始数据处理 - 使用Cell Ranger v7.0.0进行序列比对与定量 - 参考基因组：mm10 (GENCODE M25) - 比对率需>75% 2. 数据预处理 - 使用Seurat v5.0进行质量控制 - 过滤标准：基因表达数>200 & <6000/细胞；线粒体基因表达<25% - DoubletFinder去除双细胞污染 - 批次效应校正：Harmony v1.0 3. 细胞聚类与注释 - UMAP降维，Resolution 0.4-0.8 - 细胞类型注释：基于已知标记基因 - 精原细胞：Kit, Id4, Ret - 精母细胞：Spo11, Dmc1, Sycp3 - 圆形精子细胞：Prm1, Prm2, Tnp1 - 成熟精子细胞：Acrv1, Spam1 - 支持细胞：Sox9, Amh - 间质细胞：Lhcgr, Star 4. 差异表达分析 - 使用DESeq2进行基因型间差异表达分析 - 筛选标准：|log2FC| > 0.5, padj < 0.05 5. 基因集富集分析 - GO term富集：clusterProfiler - KEGG pathway分析 - GSEA分析精原细胞维持、减数分裂、精子形成相关基因集 **软件与数据库：** - Cell Ranger v7.0.0 (10x Genomics) - Seurat v5.0 (R package) - Harmony v1.0 - DESeq2 v1.38.0 - clusterProfiler v4.0 --- ### 阶段 V：验证实验（第16-22周） **方法：** 1. 流式细胞术(FACS)验证细胞群体比例 - 抗体组合： - FITC anti-mouse CD44 (BD, #553134) - PE anti-mouse GATA1 (R&D, #MAB4517) - APC anti-mouse PNA (Vector Labs, #FL-1071) - 分析至少50,000个事件/样本 - 用FlowJo v10.8进行数据分析 2. RNAscope原位杂交验证关键基因表达 - 使用Advanced Cell Diagnostics RNAscope Multiplex Fluorescent Kit - 探针：Mlh3, Hormad1, Cul4a, Cnp以及关键差异表达基因 - 在Leica DMi8共聚焦显微镜下成像 3. qRT-PCR验证 - 提取各基因型睾丸总RNA (RNeasy Mini Kit, Qiagen) - 逆转录：SuperScript IV (Thermo Fisher) - qPCR：PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher) - 使用ΔΔCt法进行相对定量，以Gapdh作为内参 **对照设置：** - 无模板对照(NTC)用于qPCR - 标准曲线对照用于绝对定量 - 每个基因型样本进行3次技术重复 --- ### 阶段 VI：数据整合与机制探索（第20-26周） **方法：** 1. 细胞通讯分析 - 使用CellPhoneDB v4.0推断细胞间配体-受体互作 - 使用NicheNet分析细胞间通讯方向性 2. 转录因子网络分析 - 使用SCENIC进行基因调控网络(GRN)重建 - 识别每个细胞群体的核心转录因子 3. 拟时间轨迹分析 - 使用Monocle3进行发育轨迹重建 - 识别状态转换关键节点与基因表达动态 4. 跨基因型比较分析 - 构建基因型特异性细胞图谱 - 识别各基因型的特征性细胞群体与基因表达特征 ---

Experiment Results (1)

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