FLS Stimulation and Transcriptomic Analysis

PRIMARY OUTCOME

upregulation of pro-inflammatory genes and cytokine secretion by carH3 and carH3-immune complexes

EXPECTED OUTCOMES

1. **IL-6分泌水平**：carH3-免疫复合物高浓度组（10 μg/mL）在24小时时间点将比vehicle对照组增加8-12倍（预计范围：800-1500 pg/mL vs. 对照组80-120 pg/mL） 2. **IL-8分泌水平**：carH3-免疫复合物组IL-8分泌量预计为vehicle组的6-9倍（预计范围：600-900 pg/mL vs. 对照组80-120 pg/mL） 3. **TNF-α分泌水平**：carH3-免疫复合物处理后24小时，TNF-α分泌量预计增加5-8倍（预计范围：150-300 pg/mL vs. 对照组20-40 pg/mL） 4. **MCP-1 (CCL2) 分泌水平**：预计增加4-6倍（预计范围：400-600 pg/mL vs. 对照组80-120 pg/mL） 5. **MMP-3分泌水平**：carH3-免疫复合物组在24小时时间点预计增加10-15倍（预计范围：15-25 ng/mL vs. 对照组1-2 ng/mL） 6. **转录组测序差异表达基因数**：预计carH3-免疫复合物组vs vehicle组将鉴定出200-400个显著差异表达基因（|log2FC| ≥ 1, padj < 0.05），其中约60-70%为上调基因 7. **qPCR验证相关性**：在差异表达基因中随机选取10个基因进行qPCR验证，预计皮尔逊相关系数r ≥ 0.85（与RNA-seq结果相关性） ---

SUCCESS CRITERIA

- **统计显著性**：carH3-免疫复合物高浓度组与vehicle对照组相比，主要结局指标（IL-6、IL-8、TNF-α）分泌量差异p值 < 0.01（使用单因素方差分析ANOVA + Tukey post-hoc test） - **生物学效应阈值**：carH3-免疫复合物组与carH3单体组相比，促炎细胞因子分泌量增加 ≥ 3倍，且差异具有统计学意义（p < 0.05） - **转录组质量**：RNA样本RIN值 ≥ 8.0，每个样本测序深度 ≥ 30 million reads，Q30碱基比例 ≥ 85% - **差异表达基因富集**：促炎相关通路（如TNF signaling pathway、NF-κB signaling pathway、IL-17 signaling pathway）在GSEA分析中显著富集，NOM p-value < 0.05，FDR < 0.25 - **Isotype对照验证**：Isotype对照组与vehicle对照组之间无显著差异（p > 0.05），证明实验体系中无Fc受体非特异性激活 -

PROTOCOL

### Phase 1: 细胞培养与准备工作（第1-3天） **材料与试剂：** - 人RA成纤维样滑膜细胞（FLS），来自商业来源（Celprogen, Cat#: 3605-05或相当产品） - 完全培养基：DMEM/F-12 (Gibco, Cat#: 11320033) + 10% FBS (Gibco, Cat#: 16000044) + 1% 青霉素/链霉素 (Gibco, Cat#: 15140122) - 无酚红培养基（用于刺激实验）：DMEM/F-12无酚红 (Gibco, Cat#: 11039021) - 0.25% 胰蛋白酶-EDTA (Gibco, Cat#: 25200056) - PBS, pH 7.4 (Gibco, Cat#: 10010023) - 细胞计数板 (Neubauer improved) - T75培养瓶 (Corning, Cat#: 430641U) - 6孔培养板 (Corning, Cat#: 3516) - 96孔培养板 (Corning, Cat#: 3599) **操作步骤：** 1. 从液氮中取出RA FLS细胞，快速放入37°C水浴解冻 2. 转移细胞至T75培养瓶，加入10 mL预热完全培养基 3. 37°C、5% CO2条件下培养24小时 4. 弃旧培养基，PBS清洗2次，加入新鲜完全培养基 5. 每日观察细胞汇合度，细胞达80-90%汇合度时进行传代 6. 传代：弃培养基，PBS清洗，0.25%胰蛋白酶-EDTA消化3-5分钟 7. 中和胰蛋白酶，离心（300×g, 5分钟），重悬于完全培养基 8. 细胞计数，调整浓度至1×10^5 cells/mL ### Phase 2: carH3和carH3-免疫复合物刺激实验（第4-5天） **材料与试剂：** - carH3蛋白（重组人源化单克隆抗体，浓度：1 mg/mL in PBS） - carH3-免疫复合物（carH3与抗原以1:5摩尔比配制，室温孵育30分钟） - 抗原蛋白（人IgG或特定靶抗原，10 μg/mL） - Vehicle对照：PBS - Isotype对照抗体：Human IgG1同型对照（BioLegend, Cat#: 403502），浓度匹配carH3 - IFN-γ阳性对照：100 ng/mL (PeproTech, Cat#: 300-02) - TNF-α阳性对照：10 ng/mL (PeproTech, Cat#: 300-01A) **实验设计（6组，每组3个生物学重复）：** | 组别 | 处理 | 浓度 | |------|------|------| | 1 | Vehicle对照 | PBS | | 2 | Isotype对照 | 10 μg/mL | | 3 | carH3单体 | 10 μg/mL | | 4 | carH3-免疫复合物（低浓度） | 1 μg/mL carH3 | | 5 | carH3-免疫复合物（高浓度） | 10 μg/mL carH3 | | 6 | 阳性对照（TNF-α + IFN-γ） | 10 ng/mL + 100 ng/mL | **操作步骤：** 1. 将RA FLS细胞以1×10^5 cells/mL密度接种于6孔板，每孔2 mL 2. 37°C、5% CO2培养24小时，使细胞贴壁并达到70-80%汇合 3. 弃旧培养基，每孔加入1.8 mL无酚红DMEM/F-12（含有0.5% FBS）进行血清饥饿 4. 血清饥饿4小时后，弃培养基 5. 按实验设计添加不同处理： - 每孔加入2 mL含相应处理的新鲜培养基 - 每个处理做3个生物学重复 6. 37°C、5% CO2培养，分别在6小时和24小时时间点收集样本 7. 收集条件培养基（用于细胞因子检测），保存于-80°C 8. 用PBS清洗细胞2次，用于RNA提取 ### Phase 3: RNA提取与质量控制（第6天） **材料与试剂：** - TRIzol Reagent (Ambion, Cat#: 15596026) - 氯仿（分析纯） - 异丙醇（分析纯） - 75%乙醇（DEPC处理水配制） - DEPC处理水 (Ambion, Cat#: 4387937) - NanoDrop One分光光度计 (Thermo Fisher) - Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies) - RNA 6000 Nano Kit (Agilent, Cat#: 5067-1511) - Qubit 3.0 Fluorometer (Thermo Fisher) - Qubit RNA HS Assay Kit (Thermo Fisher, Cat#: Q32852) **操作步骤：** **总RNA提取：** 1. 每孔加入1 mL TRIzol，轻轻吹打裂解细胞 2. 室温孵育5分钟，转移至1.5 mL EP管 3. 加入200 μL氯仿，剧烈震荡15秒 4. 室温孵育2-3分钟 5. 4°C, 12,000×g离心15分钟 6. 转移上层水相至新EP管（约500 μL） 7. 加入500 μL异丙醇，颠倒混匀 8. 室温孵育10分钟 9. 4°C, 12,000×g离心10分钟 10. 弃上清，加入1 mL 75%乙醇清洗 11. 4°C, 7,500×g离心5分钟 12. 弃乙醇，空气中干燥5-10分钟 13. 加入30-50 μL DEPC处理水溶解RNA 14. 56°C孵育10分钟促进溶解 **RNA质量评估：** 1. NanoDrop检测：A260/280 ratio ≥ 1.8，A260/230 ratio ≥ 1.5 2. Qubit定量：确保RNA浓度 ≥ 100 ng/μL 3. Agilent Bioanalyzer分析： - RIN值 ≥ 8.0 - 28S/18S比值 ≥ 1.5 - 无明显DNA污染峰 ### Phase 4: 转录组测序与生物信息学分析（第7-14天） **材料与试剂：** - NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit (NEB, Cat#: E7760S) - NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module (NEB, Cat#: E7490S) - NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (NEB, Cat#: E7500S) - AMPure XP beads (Beckman Coulter, Cat#: A63880) - Agilent High Sensitivity DNA Kit (Agilent, Cat#: 5067-4626) - Illumina HiSeq 4000或NovaSeq 6000测序平台 **操作步骤：** **mRNA富集：** 1. 使用Poly(A)磁珠富集mRNA 2. 加入2×上样缓冲液，混合后65°C变性5分钟 3. 室温混匀2分钟进行mRNA结合 4. 使用磁力架分离，洗涤2次 5. 加入Tris缓冲液重悬，94°C变性 6. 室温复性，磁力分离，收集mRNA **文库构建：** 1. 进行mRNA片段化（94°C, 15分钟） 2. 第一链cDNA合成（逆转录酶，25°C 10分钟，42°C 50分钟，70°C 15分钟） 3. 第二链cDNA合成（DNA polymerase I, RNase H） 4. 末端修复和A碱基加尾 5. 接头连接 6. PCR扩增（15个循环） 7. AMPure XP beads纯化，250-300 bp片段选择 **测序与数据分析：** 1. 文库质量验证（Bioanalyzer DNA 1000） 2. 定量（qPCR） 3. 混合文库，Illumina平台测序（150 bp双端，30-50 M reads/样本） 4. 原始数据质控（FastQC） 5. 序列比对（STAR或HISAT2至GRCh38参考基因组） 6. 基因表达定量（RSEM或featureCounts） 7. 差异表达分析（DESeq2或edgeR）： - 阈值设定：|log2FC| ≥ 1, padj ≤ 0.05 8. GO富集分析（DAVID或Metascape） 9. KEGG通路分析 10. GSEA分析 ### Phase 5: 细胞因子分泌检测（第6天，与RNA收集同步） **材料与试剂：** - LegendPlex Human Inflammation Panel 1 (BioLegend, Cat#: 740808) - LegendPlex Human Cytokine Panel 2 (BioLegend, Cat#: 740809) - 或者Luminex Performance Human Cytokine Base Kit A (R&D Systems, Cat#: LKTM015A) - IL-6 ELISA Kit (BioLegend, Cat#: 430504) - TNF-α ELISA Kit (BioLegend, Cat#: 430204) - IL-8 ELISA Kit (BioLegend, Cat#: 431504) - MMP-3 ELISA Kit (R&D Systems, Cat#: DY516) - 标准品、捕获 beads、检测抗体、PE-链霉亲和素 - 96孔V底板（Corning, Cat#: 3897） - Magpix流式荧光检测仪（Luminex）或酶标仪 **检测细胞因子（14种）：** IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, MCP-1, MIP-1α, IL-10, IL-12p70, IL-17A, IL-23, MMP-3 **操作步骤：** **Multiplex检测（LegendPlex）：** 1. 取出冻存条件培养基，4°C解冻 2. 96孔V底板加入25 μL捕获beads 3. 加入25 μL标准品或样品 4. 4°C振荡孵育过夜（16-18小时） 5. 洗涤：每孔加入200 μL洗涤缓冲液，1000×g离心5分钟，弃上清 6. 加入25 μL检测抗体混合物 7. 室温振荡孵育1小时 8. 加入25 μL PE-链霉亲和素 9. 室温振荡孵育30分钟 10. 洗涤2次 11. 每孔加入150 μL读数缓冲液 12. Magpix仪器读取 **ELISA验证：** 1. 96孔板包被捕获抗体，4°C过夜 2. 洗涤，阻断液封闭1小时 3. 加入样品或标准品，37°C孵育2小时 4. 洗涤，加入检测抗体，37°C孵育1小时 5. 洗涤，加入TMB底物，室温避光显色 6. 加入终止液，450 nm读数 ### Phase 6: qPCR验证差异表达基因（第15-17天） **材料与试剂：** - PrimeScript RT Reagent Kit (Takara, Cat#: RR037A) - TB Green Premix Ex Taq II (Takara, Cat#: RR820A) - 实时荧光定量PCR仪（Applied Biosystems 7500 Fast） - 96孔PCR板 (Applied Biosystems, Cat#: 4346906) - 基因特异性引物（见下表） **验证基因引物序列：** | 基因 | Forward Primer (5'-3') | Reverse Primer (5'-3') | |------|------------------------|------------------------| | IL6 | CTGCAGCCACTGGTTCTGT | CCAGAGCTGTGCAGATGAGTA | | CXCL8 (IL8) | AAGAGAGCTGTGTCCTTGGGT | GGGGTGGAAAGGTTTGGAGT | | TNF | AGGACGAACATCCAACCTTC | GTTGACCTTGGTCTGGTAGGA | | CCL2 (MCP1) | AGCAACTGTGACCGCGAGCTTC | CGAGCAGACTGCCCACTCAACC | | MMP3 | AGGCATCGAGAGTGGTCATG | CACTTGGCTGAGTGGTAGAGT | | CXCL10 | CCATTCTGATTTGCTGCCTTAT | GGTACAGTGGGCTCATTCCA | | CCL20 | TACTCCACCTCTGACACCTC | GACACCTTCATCAAAAGCCTG | | CXCL1 | AGCTTGCCTCAATCCTGCAT | GTGCATTCCGCTCGAGGTTT | | IL1B | CCAGCTACGAATCTCCGACC | TCTTTCAACACGCAGGACAG | | MMP13 | CCAGCTGTCCTTGGCACTC | GCATCTGGAGTCCTTGAAGGT | **操作步骤：** 1. 使用Takara PrimeScript RT Kit进行逆转录： - 20 μL体系：4 μL 5×PrimeScript Buffer, 1 μL PrimeScript RT Enzyme, 1 μL Oligo dT, 1 μL Random 6 mers, 10 μL RNA (1 μg) - 条件：37°C 15分钟，85°C 5秒 2. qPCR反应（20 μL体系）： - 10 μL TB Green Premix Ex Taq II - 0.8 μL Forward Primer (10 μM) - 0.8 μL Reverse Primer (10 μM) - 2 μL cDNA (1:5稀释) - 6.4 μL RNase Free Water 3. qPCR程序： - 95°C 30秒（预变性） - 40个循环：95°C 5秒，60°C 30秒 - 熔解曲线：95°C 15秒，60°C 1分钟，95°C 15秒 4. 数据分析：ΔΔCt方法，以GAPDH或β-actin为内参基因 5. 计算相对表达量：2^(-ΔΔCt) ---

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